펩타이드 핵산 개발

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 12482(2023) 이 기사 인용

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식품 안전을 보장하기 위해 식품 매개 병원체를 검출하는 수많은 새로운 방법이 광범위하게 개발되었습니다. 중요한 식중독균 중 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)가 다양한 식품 질환을 일으키는 우려 병원체로 확인되어, 이 병원체에 대한 효과적인 검출 방법 개발에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 배양과 생화학적 확인시험을 기반으로 한 표준방법이 있지만 시간과 노동집약적이다. 대체 PCR 기반 방법이 개발되었지만 높은 처리량 용량과 사용 용이성이 부족합니다. 따라서 본 연구에서는 고도로 특이적인 피롤리디닐 펩타이드 핵산(PNA)을 다중 및 높은 처리량 용량을 갖춘 비드 어레이 방법의 프로브로 활용하여 B. cereus 검출을 위한 강력한 방법을 개발하려고 합니다. 이 연구에서는 groEL, motB 및 16S rRNA 서열이 포함된 ACPC(프롤릴-2-아미노사이클로펜탄카르복실산) 백본을 보유하는 PNA를 형광 바코드 비드 3세트와 공유 결합하여 3개의 B. cereus 유전자를 검출했습니다. 개발된 acpcPNA 기반 비드 어레이는 B. cereus가 있는 경우 신호만 감지할 수 있고 다른 종에서는 감지할 수 없는 우수한 선택성을 나타냈습니다. 게놈 DNA를 검출하는 이 acpcPNA 기반 비드 분석의 민감도는 groEL, motB 및 16S rRNA에 대해 각각 0.038, 0.183 및 0.179ng인 것으로 나타났습니다. 이 성능은 DNA 대응물보다 확실히 우수하여 DNA에 대한 acpcPNA의 결합 강도가 훨씬 더 강력하다는 것을 확인했습니다. 개발된 방법의 견고성은 식품 측정 기준의 간섭을 최소화하면서 인공적으로 첨가한 우유와 절인 겨자잎을 테스트함으로써 더욱 입증되었습니다. 따라서 이 개념 증명 acpcPNA 기반 비드 어레이 방법은 식품 매개 병원체에 대한 효과적인 대체 핵산 기반 방법으로 사용되는 것으로 입증되었습니다.

바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 바로 먹을 수 있는 식품, 발효 식품, 유제품에 이르기까지 광범위한 식품에서 발견될 수 있는 주요 식품 매개 병원체 중 하나입니다1. 극한의 pH와 온도에 대한 내성으로 인해 B. cereus는 식품 가공의 다양한 단계에서 흔히 발견되었으며2, 전체 유병률은 23.746%에 달해 전 세계적으로 심각한 식품 매개 발병을 초래했습니다. 유럽에서는 황색포도상구균에 이어 식중독 발생의 두 번째 원인입니다3. 미국에서는 연간 약 63,000명이 병에 걸렸으며, Bacillus 그룹에 의한 입원율은 0.4%4였습니다.

식품 내 B. cereus를 적시에 모니터링하고 검출할 수 있는 신속하고 정확한 방법은 B. cereus의 발생을 줄이는 주요 완화 방법이 될 수 있습니다. 더욱이 모든 Bacillus 종이 병원성이 있는 것은 아니라는 점을 감안할 때 Bacillus 종 수준까지 식별할 수 있는 것이 필수적입니다5. 표준 ISO 7932:2004 방법은 한천 플레이트 기반 계산 프로토콜을 기반으로 사용할 수 있지만6 이 방법은 시간과 노동력이 많이 소요됩니다(30°C에서 최대 24시간의 배양 기간이 필요하며 확인을 위해 추가로 2~7일이 필요함). 분석), 훈련된 전문가가 필요합니다. B. cereus7,8을 식별하기 위해 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기반 기술과 같은 대체 분자 방법이 개발되었습니다. 그러나 이러한 PCR 기반 방법의 대부분은 PCR 산물을 시각화하기 위해 저해상도 겔 전기영동 방법에 의존하므로 결과 해석이 어렵습니다. 따라서 정량적 PCR(qPCR) 및 멀티플렉스 PCR과 같은 많은 고급 PCR 기반 기술이 이러한 한계를 극복하기 위해 개발되었지만9,10,11, 프라이머 이합체 형성으로 인한 합병증으로 인해 멀티플렉스 용량이 여전히 제한되어 있습니다. 또한 대부분의 PCR 기반 방법은 DNA를 특정 프로브로 사용하는데, DNA는 온도, pH, 효소 등 환경 요인에 의해 분해될 수 있습니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 본 연구에서는 멀티플렉스 용량의 장점과 비드 어레이 기술의 결과 획득 용이성 및 고도로 특이적인 펩타이드 핵산(PNA)을 대체 프로브로 결합하여 B. cereus에 대한 검출 방법을 선보입니다. 본 연구에 사용된 비드 어레이 플랫폼은 다양한 유형의 표적에 대한 높은 처리량, 민감성 및 다중 xMAP 기술을 기반으로 합니다. 이 방법은 친핵성 리간드의 공유 부착을 위해 카르복실기로 기능화된 상자성 형광 바코드 비드를 활용합니다. 각 비드 세트는 빨간색 레이저로 식별할 수 있으며 신호는 녹색 레이저에 의해 형광 리포터(R-phycoerythrin)에서 측정됩니다. 전통적인 DNA 마이크로어레이 기술과 비교하여 비드 어레이 기술은 몇 가지 장점을 제공합니다. 첫째, 이 기술의 처리량은 확실히 더 큽니다. 이는 반자동으로 간주되는 반면 DNA 마이크로어레이 기술은 그렇지 않기 때문입니다. 둘째, 자동 세척 단계로 인해 비드 어레이 기술은 일반적으로 DNA 마이크로어레이 기술보다 낮은 배경과 높은 일관성을 나타냅니다. 마지막으로, 비드 어레이 기술은 검출기 비용이 DNA 마이크로어레이에 비해 훨씬 저렴해 실용성이 높다. 따라서 다양한 DNA 기반 비드 어레이 시스템은 식품 알레르기 항원18, 닭고기의 식인성 병원체 및 Salmonella Typhimurium, Brucella spp., B. cereus 및 Shigella를 포함한 4가지 식인성 병원체와 같은 다양한 식품 오염을 검출하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 종. 유제품20. 흥미롭게도 B. cereus 검출을 위해 보고된 방법은 검출 가능한 신호를 얻기 위해 38°C에서 높은 온도가 필요했는데, 이는 PNA-DNA 결합에 비해 DNA-DNA 결합의 안정성이 낮기 때문일 수 있습니다. 이로 인해 실제 산업 처리에는 실용적이지 않습니다. 더욱이, 보고된 이러한 모든 비드 어레이 방법은 DNA를 특정 프로브로 활용했으며, 그 특이성은 하이브리드화 온도와 프로브 길이에 크게 좌우됩니다. 우리는 DNA 표적에 대한 더 나은 결합 친화력을 가진 대체 핵산 모방체의 사용이 전반적인 감지 성능을 향상시킬 수 있다고 추측했습니다.